取普通清洁试管7支，标号，1号管为空白，2～7管用微量注射器分别加1.0mg/mL的牛血清白蛋白（即标准蛋白质）溶液10，20，40，60，80，100mL。各管均用0.015mol/L PBS缓冲液补充到100mL（即0.1mL），详见表6-1。混匀待用。

表13-1标准曲线的制作

管号	标准蛋白质（mL）	缓冲液（mL）	总体积（mL）
1	0	100	100
2	10	90	100
3	20	80	100
4	40	60	100
5	60	40	100
6	80	20	100
7	100	0	100

    另取3支清洁试管，编号8、9、10，用微量注射器按表6-2操作，将待测蛋白配成系列浓度。

 

表13-2待测蛋白的稀释

管号	待测蛋白质（mL）	缓冲液（mL）	总体积（mL）	稀释倍数
8	20	80	100	5
9	40	60	100	2.5
10	60	40	100	1.67

 

    各试管充分混匀后，用取样器分别加入5.0mL考马斯亮兰G250试剂，每加完一管，立即混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。

 

    各管室温静置2～5min后，在分光光度计上测定595nm处的光吸收值 A ₅₉₅ ，空白对照为第1号试管，标准和待测蛋白样同时比色。

 

    注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），只能使用玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇润洗，洗去颜色。

                           

    以标准蛋白质浓度（mg/mL）为横座标、吸光度值 A ₅₉₅ 为纵座标作图，即得到一条标准曲线。

 

    在标准曲线上，根据测出的待测样品的 A ₅₉₅ 值，查出试管中蛋白质浓度，再按照计算公式：

待测蛋白质的浓度（mg/mL）＝查出的浓度×稀释倍数

　

计算

管号		标准蛋白质（m L ）	缓冲液（m L ）	G-250试剂（mL）	每管中的蛋白质浓度（mg/mL）	光吸收值（ A 595 ）
标 准 蛋 白	1	0	100	5	0
	2	10	90	5	0.1
	3	20	80	5	0.2
	4	40	60	5	0.4
	5	60	40	5	0.6
	6	80	20	5	0.8
	7	100	0	5	1.0

 

 

管号		待测蛋白质（m L ）	缓冲液（m L ）	G250试剂（mL）	A 595	查出的浓度（mg/mL）	稀释倍数	待测蛋白质浓度（mg/mL）
待测蛋白	8	20	80	5			5
	9	40	60	5			2.5
	10	60	40	5			1.67

 

结果：待测蛋白质的浓度为：          mg/mL