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吖啶橙区分活细胞DNA和RNA的荧光组织化学染色法

2014-07-10

    吖啶橙《acridine oran。AO)属于三环杂芳香类异嗜性阳离子荧光染料,主要以两种方式与核酸结合,一是嵌入核酸双链的碱基对之间;二是与单链核酸的磷酸发生静电相互作用。当吖啶橙与DNA或RNA结合时,最大发射波长分别为525nm或650nm,产生绿色荧光或橙红色荧光,因此,吖啶橙是研究核酸的一种常用荧光 组织化学   染料。下面介绍应用吖啶橙区分活细胞和原位组织细胞DNA和RNA荧光组织化学染色法。

 
    1.溶液配制
    (1)吖啶橙浓缩液(4℃、避光,可保存数月)
    双蒸水    50ml
    吖啶橙    50mg
 
    (2)甲液
    双蒸水        200ml
    HCl           16ml
    NaCl          1.74g
    Triton X-100    0.2ml
 
    (3)乙液
    0.2mol/LNa2HP04/0.1mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)
    双蒸水                100ml
    Na2 HP04?12H20      4.51g
    枸橼酸(无水柠檬酸)     0.71g
    溶解后,依次加入以下试剂和吖啶橙浓缩液
    NaCl(0.15mol/L)     0.87g
    EDTA-Na(1mmol/1)    0.037g
    吖啶橙浓缩液          0.6ml
    加入吖啶橙浓缩液后,应尽早使用。
 
    2.操作程序
    (1)取0.2ml含10%小牛血清的细胞悬液,再与0.4ml冷“甲液”混合,振荡15秒;
    (2)加入l.2ml"乙液”,充分混匀;
    (3)于10分钟内,荧光显微镜观察,激发波长为488nm。
    结果:DNA为黄绿色荧光,而RNA为橘红色荧光。如果同时进行DNA和RNA染色时,需用鳌合剂处理,使双链RNA变性,确保所有的RNA均为单链,而双链DNA不受影响,增加结果的可信性。鳌合剂以乙二胺四乙酸(EDTA)为佳。