FCM检测细胞凋亡技术服务

1、 FCM检测细胞凋亡服务流程

① 培养细胞，分为阴性对照组与细胞凋亡诱导组等实验组;

② PBS清洗细胞2～3次，调整细胞密度为1×106个/ml;

③ 将细胞悬液100ul转移至试管中;

④ 加入FITC标记的annexin V和PI溶液，轻轻混匀;

⑤ 室温避光放置10～15min;

⑥ 加入400ul 1×结合缓冲液，将全部液体转移至FACS分析用试管;

⑦ 尽快进行FACS分析。

注：以上流程是以PS外翻法为例，根据FCM检测细胞凋亡方法不同，操作步骤有所区别。

2、 FCM检测细胞凋亡原理

流式细胞仪(flow cytometry或flow cytomyter，FCM)又称荧光活化细胞分拣器(fluorescence activated cell sorter，FACS)是20世纪60年代后期利用激光器和层流流动室而建立的一种用于测定放射性染色体的新技术。此后，随着电脑等电子技术的进步，其性能日臻完善，操作更加简单，在肿瘤学、免疫学、微生物学及临床检查方面的应用也更为普及。凋亡为细胞死亡的方式之一，在胚胎学或个体状态维持方面具有重要作用，大多数抑瘤药物通过诱导细胞凋亡发挥药效。其检测方法包括形态学、生物化学和DNA法等。FCM检测细胞凋亡原理是：①通过DNA片段化细胞来判定：用碘化吡啶(PI)对细胞染色，判断细胞周期，进而测定凋亡细胞的DNA片段化程度。②)通过磷脂酰丝氨酸( phosphatidylserine，PS)外翻进行判定：磷脂酰丝氨酸(利用其与膜联蛋白V(annexin V)结合的特性判定发生凋亡的细胞，测定死亡细胞数目。Annexin V为320个氨基酸的蛋白质，在生理钙浓度下对PS的亲和性很高。活细胞内annexin V也有一定程度的结合。因此，通过比较诱导细胞凋亡前后annexin V结合能力的变化可进行其结果分析。)。Annexin V与PS结合时依赖于钙离子。用FACS进行解析时，因需用鞘液稀释反应液，所以早期的数据可靠性高。

3、 FCM检测细胞凋亡所需材料

① FCM检测细胞凋亡试剂：

a:RNase A溶液(0.1mg/ml，用于DNA片段化细胞法);

b:70%乙醇(DNA片段化细胞)或结合缓冲液(PS外翻);

c: 0.1% BSA;

d: PI溶液和或annexin V-FITC溶液;

e:PBS;

f:胰蛋白酶消化液;

② FCM检测细胞凋亡耗材：

a:待检样本(培养细胞);

b:无菌离心管;

c:无菌tip头;

③ 仪器：

a:流式细胞仪(图1 BD FACSCaliber);

b:台式低速离心机;

图1流式细胞仪

4、 材料要求

① 避免细胞污染;

② 实验材料涉及危险品，loogene公司不予服务;

③ 待检细胞尽量新鲜，生长状态良好;

④ 提供尽量详细的实验背景材料。

5、 实验周期

① 1-10个样本，7个工作日

② 10-50个样本，20个工作日

③ 50个样本以上，30个工作日

6、 提供结果

完整的实验操作步骤、FCM检测细胞凋亡分析(图2，图3)等结果。

图2 FCM细胞凋亡对照组 图3 FCM细胞凋亡实验