1  介绍

浓缩果汁中有时含有导致腐败的芽孢菌，耐酸耐热菌，也叫TAB，它们的特点是：

1）  能耐热的孢子；

2）  能耐果汁中的酸；

3）  能在含有很少量的氧中生长；

这个程序描述了检验浓缩苹果清汁（比如苹果）的TAB的检验方法。

2   设备和试剂

2.1  设备

2.1.1  三角瓶：1000ml。

2.1.2  灭菌的99ml的去离子水的稀释空白。

2.1.3  磁力搅拌棒。

2.1.4  带有搅拌器的加热盘。

2.1.5  塑料注射器：10ml。

2.1.6  注射用的滤膜装置(0.45um)。

2.1.7  灭菌培养皿：90mm。

2.1.8  恒温水浴锅：74-76°C。

2.1.9  恒温培养箱：43±1℃。

2.1.10 广口灭菌吸管：25ml。

2.1.11 一次性的带有螺旋盖子的试管。

2.1.12 可以无菌过滤0.45um的过滤装置。

2.1.13 异丙基酒精。

2.2   试剂

2.2.1 酵母粉(VWR DF0127-15)

2.2.2 蛋白胨(VWR DF0118-15)

2.2.3 琼脂粉(VWR DF0145-17)

2.2.4 葡萄糖(VWR EM-DX0145-11)

2.2.5 吐温80(VWR JTX 257-7)

2.2.6 苹果酸(VWR JTP494-7)

3   操作步骤

3.1 配制K氏培养基，在一个1升的烧瓶中，加入：

3.1.1 去离子水：500-mL

3.1.2 酵母粉： 1.25-g

3.1.3 蛋白胨： 2.50-g

3.1.4 琼脂粉： 7.50-g

3.1.5 葡萄糖： 0.50-g

3.1.6 吐温80：0.50-mL

3.1.7 磁力搅拌装置

或者直接购买K氏培养基，按照厂家的说明配制。

3.2  加热使药品充分溶解。

3.3  轻轻的盖上烧瓶的塞子，将培养基在15磅下高压灭菌25分钟。

3.4  在一个小烧杯中加入1.0克的苹果酸和10 ml去离子水，搅拌使其溶解。

3.5  将苹果酸的溶液抽入10ml的一次性塑料注射器中。

3.6  在塑料注射器的末端进行无菌的滤膜过滤。

3.7  K氏培养基灭菌结束后，将苹果酸的溶液用注射器无菌的滤膜过滤到K氏培养基中，充分摇匀。

3.8    当培养基冷却到大约50°C时，将酸化后的培养基倒入到一次性培养皿中。

3.9    等待培养基凝固后，在≤5°C的条件下冷藏，可以保存60天。

3.2  采样

3.2.1 样品不必采取无菌的方式采集，但是要防止和其他样品的交叉污染。

3.2.2 采样的容器必须是灭菌的。

3.2.3 取样时，从大桶中取样出来所用的器具应先用水清洗，然后在200ppm的有效氯中浸泡后，才可以浸入大桶中取样。

3.3 热冲击

3.3.1 调节水浴锅到74-76°C。

3.3.2 用一个广口吸管吸取1ml样品于带有盖子的试管中，准备测试。

3.3.3 加入10ml灭菌水。

3.3.4 紧紧的盖上试管的盖子。

3.3.5 将此样品放到水浴锅中，用计时器计时13分钟。

4  数据分析

4.1  将热冲击后的样品加入到99ml的灭菌水空白中，充分混匀。

4.2  用一次性的0.45um的滤膜过滤稀释液。

4.3  移开过滤器的上部。                                                       

4.4  将镊子的尖端在酒精中浸后，点燃灭菌。

4.5  用这个灭菌的镊子将滤膜夹到K氏培养基上。

4.5  轻敲滤膜使它紧贴到K氏培养基上。

4.6  盖上培养皿的盖子，把培养皿包起来，以减少培养基的干燥。

4.7  在培养箱底部的架子上放一盘去离子水，以保证培养箱内潮湿防止培养基干裂。

4.8  放置培养皿时，将培养皿的盖子朝下。

4.9  在43°C 下培养 5天，记录滤膜上的菌落数，它们是1ml的浓缩果汁样品的TAB数目。

参考资料：Coca Cola公司耐热耐酸菌的检测。